Aktywność star - Polski Serwis Naukowy

Aktywność star – własność enzymów restrykcyjnych polegająca na obniżeniu lub zaniku specyficzności ich działania, objawiająca się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne. Wraz ze spadkiem specyficzności, cięciu podlegają miejsca coraz bardziej różne od oryginalnej sekwencji restrykcyjnej. Nazwa zjawiska pochodzi od oznaczenia alternatywnej aktywności, w odróżnieniu od zwykłej, znakiem * (EcoRI* zamiast EcoRI). Obecnie produkowane są sztucznie rekombinowane enzymy ze zmniejszoną lub zniesioną aktywnością star.

Wartościowość to cecha pierwiastków chemicznych i grup funkcyjnych w chemii określająca iloma wiązaniami chemicznymi może się dany pierwiastek łączyć z innymi.

Miedź (Cu, łac. cuprum) – pierwiastek chemiczny, z grupy metali przejściowych układu okresowego. Nazwa miedzi po łacinie (a za nią także w wielu innych językach, w tym angielskim) pochodzi od Cypru, gdzie w starożytności wydobywano ten metal. Początkowo nazywano go metalem cypryjskim (łac. cyprum aes), a następnie cuprum. Posiada 26 izotopów z przedziału mas 55-80. Trwałe są tylko dwa: 63 i 65.

Najczęstszy zanik specyficzności polega na cięciu sekwencji różniących się od restrykcyjnej jednym nukleotydem, cięciu sekwencji krótszych o nukleotydy początkowe.

Na pojawienie się aktywności star w reakcjach z udziałem enzymów restrykcyjnych ma wpływ wiele czynników (choć każdy z różną siłą i to zależnie od enzymu, np. EcoRI jest bardziej wrażliwy na podwyższone stężenie glicerolu niż na podwyższone pH), między innymi:

wysokie stężenie glicerolu (powszechny składnik buforów do przechowywania enzymów);

nadmiar enzymu do ilości DNA;

niska siła jonowa (<25mM);

wysokie pH (>8,0);

obecność odczynników organicznych (DMSO, etanol, glikol i inne);

zastąpienie jonów Mg innymi jonami metali dwuwartościowych: Mn, Cu, Co, Zn.

Aktywność star jest zwykle zjawiskiem niepożądanym, utrudniającym i wprowadzającym zmienność do przeprowadzanego eksperymentu. Problem ten staje się wyraźny w przypadku reakcji z użyciem kilku enzymów restrykcyjnych naraz (cięcie wielokrotne), gdy trudne jest zapewnienie warunków optymalnych każdemu z nich.

Magnez (Mg, łac. magnesium) - pierwiastek chemiczny, metal ziem alkalicznych (druga grupa główna układu okresowego). Izotopy stabilne magnezu to 24Mg, 25Mg oraz 26Mg.

Mangan (Mn, łac. manganium) to pierwiastek chemiczny, z grupy metali przejściowych w układzie okresowym. Ma 15 izotopów z przedziału mas 49-62 i izomery jądrowe 51m, 52m, 54m. Trwały jest tylko izotop 55, który stanowi niemal 100% składu izotopowego manganu występującego w naturze. Posiada 5 różnych stopni utleniania (od I do VII), z czego trwałe są tylko 3 (II, IV, VII).

Aktywność star można redukować stosując się do zaleceń producenta enzymów, takich jak:

używania enzymu w minimalnej ilości potrzebnej do pocięcia danej ilości DNA (zmniejsza ilość glicerolu w próbce oraz zapewnia odpowiedni stosunek enzymu do DNA, wydłuża jednak czas reakcji);

pozbycie się śladów odczynników organicznych (szczególnie etanolu używanego powszechnie do izolacji DNA);

zapewnienie odpowiednio wysokiej lub specjalne zawyżanie siły jonowej (niektóre enzymy są jednak inhibowane przez wysoką siłę jonową);

utrzymywanie pH reakcji w okolicach 7,0 (wyższe pH reakcji bywa efektem używania niewystarczająco czystego DNA izolowanego metodą lizy alkalicznej);

używanie Mg jako jonów dwuwartościowych wspomagających pracę enzymu i unikanie zanieczyszczeń innymi jonami.

Przypisy

↑ Nasri M., Thomas D. Relaxation of recognition sequence of specific endonuclease HindIII.. „Nucleic Acids Res”. 03;14. 2, s. 811-21, 1986. PMID 3003698.
↑ Polisky B., Greene P., Garfin DE., McCarthy BJ., Goodman HM., Boyer HW. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 02;72. 9, s. 3310-4, 1976. PMID 242001.
Gardner RC., Howarth AJ., Messing J., Shepherd RJ. Cloning and sequencing of restriction fragments generated by Eco RI*.. „DNA”. 05;1. 2, s. 109-15, 1983. PMID 6299666.
Barany F. The TaqI 'star' reaction: strand preferences reveal hydrogen-bond donor and acceptor sites in canonical sequence recognition.. „Gene”. 09;65. 2, s. 149-65, 1988. PMID 2842230.
George J., Blakesley RW., Chirikjian JG. Sequence-specific endonuclease Bam HI. Effect of hydrophobic reagents on sequence recognition and catalysis.. „J Biol Chem”. 09;255. 14, s. 6521-4, 1980. PMID 6248525.
Malyguine E., Vannier P., Yot P. Alteration of the specificity of restriction endonucleases in the presence of organic solvents.. „Gene”. 05;8. 2, s. 163-77, 1980. PMID 6244210.

Bibliografia

Star Activity (relaxed or altered specifity) (ang.). New Englands Biolabs Inc.. [dostęp 19-08-2008].