Barwienie metodą Grama - Polski Serwis Naukowy

Metoda Grama – metoda barwienia bakterii. Pozwala doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie, także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki.

Została opracowana w 1884 przez Duńczyka, Hansa Christiana Grama (1853–1938).

Przetrwalnik (endospora, spora, gr. σπορα tzn. nasienie) – formy spoczynkowe umożliwiające organizmom przetrwanie niekorzystnych dla nich warunków (susza, niskie temperatury).

Jod (I, łac. iodum) – pierwiastek chemiczny, z grupy fluorowców w układzie okresowym. Jego nazwa pochodzi od gr. ἰοειδής ioeides – fioletowy.

Sposób barwienia

na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę hodowli płynnej lub w przypadku hodowli stałej nanieść 1-2 krople soli fizjologicznej i wykonać rozmaz

szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalić (dzięki temu procesowi jest łatwiejsze wnikanie barwnika do wnętrza komórki):

fizycznie: trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika;

chemicznie: poprzez użycie np.: formaliny lub etanolu z domieszką eteru;

utrwalony preparat zalewać nad rynienką roztworem fioletu krystalicznego z dodatkiem 1-2% fenolu

odczekać 60 sekund do 3 minut

tryskawką delikatnie zmyć barwnik

zalać preparat jodyną lub płynem Lugola

odczekać 30 sekund do 2 minut

ostrożnie odbarwić całość w etanolu przez ok. 10-20 sekund

spłukać preparat wodą destylowaną

dobarwić innym barwnikiem, np. safraniną czy fuksyną zasadową przez ok. 30 sekund

dobrze spłukać preparat wodą destylowaną i po wyschnięciu oglądać pod mikroskopem

Mechanizm barwienia

Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.
Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe.
Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1–2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu (niedobór magnezu może powodować barwienie na czerwono bakterii zasadniczo Gram-dodatnich) i zasadowego białka które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach lub bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet.
Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-ujemne – bezbarwne.
Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram-ujemne, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

Efekt barwienia Grama

W efekcie wyżej przedstawionych działań i opisanego mechanizmu komórki efekty mogą być trojakie:

Fizjologia (gr. φυσιολογία, od φύσις - natura + λόγος - nauka) – nauka o czynnościach życiowych organizmów. Bada ona prawa rządzące pracą narządów, komórek, tkanek

Ściana komórkowa - martwy składnik komórki, otoczka komórki o funkcji ochronnej i szkieletowej. Ściana komórkowa występuje u roślin, grzybów, bakterii i niektórych protistów. U każdej z tych grup jest zbudowana z innych substancji, np. u grzybów jest to chityna, a u roślin celuloza i jej pochodne (hemiceluloza i pektyna) oraz lignina, natomiast u bakterii podstawowym składnikiem jest mureina. Ściana komórkowa leży na zewnątrz błony komórkowej. W tkankach ściany komórkowe sąsiadujących ze sobą komórek są zlepione pektynową substancją tworzącą blaszkę środkową. Między komórkami istnieją wąskie połączenia w postaci plasmodesm - wąskich pasm cytoplazmy przenikających ściany i zawierających fragmenty retikulum endoplazmatycznego. Młode komórki roślin otoczone są ścianą pierwotną, której strukturę wewnętrzną stanowią ułożone w sposób nieuporządkowany łańcuchy celulozowe wypełnione hemicelulozą i pektyną. W starszych komórkach obserwuje się również ścianę wtórną - powstającą po wewnętrznej stronie ściany pierwotnej, zwykle grubszą i bardziej wytrzymałą niż pierwotna, o uporządkowanej budowie szkieletu celulozowego, również wypełnionego hemicelulozą i pektyną. Ulega ona inkrustacji (węglan wapnia, krzemionka lub lignina) i adkrustacji (kutyna, suberyna, woski).

bakterie barwiące się na kolor ciemnofioletowy, prawie czarny, określamy jako Gram-dodatnie lub (Gram +),

bakterie odbarwiające się pod wpływem etanolu z koloru ciemnofioletowego na kolor czerwony, określamy jako Gram-ujemne lub (Gram -),

bakterie nie barwią się standardową metodą Grama, np. prątki (są trudnobarwliwe – można je wybarwić poprzez wydłużenie czasu dla fioletu krystalicznego i płynu Lugola),

bakterie Gram-zmienne, np. Gardnerella vaginalis.

Efekt barwienia zależy od podłoża i wieku hodowli:

Utrwalanie preparatu mikroskopowego - zabieg mający na celu zabicie (bez zniszczenia) form wegetatywnych drobnoustrojów, przyklejenie ich do szkiełka podstawowego i przygotowanie do barwienia. Polega najczęściej na trzykrotnym krótkim wprowadzeniu preparatu w stożek płomienia palnika gazowego.

Laseczka sienna (Bacillus subtilis) – Gram-dodatnia bakteria należąca do rodziny Bacillaceae. Odkryta przez Christiana Ehrenberga w 1835 roku i nazwana Vibrio subtilis. Pod nazwą B. subtilis występuje od 1872 roku (Ferdinand Cohn).

starsze hodowle Clostridium mogą barwić się Gram-ujemnie

kiełkujące endospory (i pierwsze pokolenie po wykiełkowaniu) Bacillus subtilis barwią się Gram-ujemnie

Zobacz też

inne metody barwienia

Przypisy

↑ pod redakcją Janusza Wawrzkiewicza: Mikrobiologia weterynaryjna. Warszawa: Państwowe Wydawnictwo Naukowe, 1981, s. 41. ISBN 83-01-03727-X.

Bibliografia

Władysław J.H. Kunicki- Goldfinger: Życie bakterii. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 1998. ISBN 978-83-01-14378-7.