ELISA - test immunoenzymatyczny - Polski Serwis Naukowy

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), czyli test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny – jeden z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem. W podstawowej wersji testu ELISA, pewna ilość antygenu unieruchomiona jest na powierzchni fazy stałej. Wykonanie testu polega na wprowadzeniu materiału biologicznego zawierającego przeciwciała specyficzne dla unieruchomionego antygenu. Przeciwciała te powinny być uprzednio połączone wiązaniem kowalencyjnym z enzymem. Unieruchomiony antygen i specyficzne przeciwciało tworzą kompleks immunologiczny, dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem. Po przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu odpowiedniego substratu, enzym związany ze specyficznym przeciwciałem katalizuje reakcję, której produkt (najczęściej barwny) można oznaczyć spektrofotometrycznie. Należy jednak zdawać sobie sprawę z faktu, że przedstawiony powyżej opis działania metody jest silnie uproszczony i może podlegać wielu modyfikacjom, a najważniejsze z nich przedstawiono w dalszej części artykułu.

Spektrofotometria - technika spektroskopowa polegająca na ilościowym pomiarze absorpcji, emisji lub odbicia światła. W technikach spektrofotometrycznych mierzy się, a także porównuje z wzorcem intensywność światła dla poszczególnych częstości (lub długości fali) widma spektroskopowego, natomiast w pozostałych technikach spektroskopowych pomiar intensywności światła na ogół ma drugorzędne znaczenie, a bardziej istotne jest występowanie i kształt sygnałów w widmach. Od zwykłej fotometrii różni się zaś tym, że umożliwia pomiar światła w zależności od długości światła.

Izotopy – odmiany pierwiastka chemicznego różniące się liczbą neutronów w jądrze atomu (z definicji atomy tego samego pierwiastka mają tę samą liczbę protonów w jądrze). Izotopy tego samego pierwiastka różnią się liczbą masową (łączną liczbą neutronów i protonów w jądrze), ale mają tę samą liczbę atomową (liczbę protonów w jądrze).

Test ELISA należy do szerszej grupy tzw. testów fazy stałej, ale nie jest pierwszym, który został wynaleziony, chociaż jest jednym z najczęściej stosowanych. Pierwszą metodą z tej grupy, w której stosuje się przeciwciała znakowane radioizotopem, jest test RIA, za wynalezienie którego Rosalyn Sussman Yalow w 1977 roku otrzymała Nagrodę Nobla.

Spektrofotometr – aparat umożliwiający równoczesną analizę spektralną światła i pomiar strumienia świetlnego. Stosowany jest m.in. w absorpcyjnej analizie spektralnej do pomiaru przepuszczalności lub absorpcji promieniowania w funkcji długości fali.

Immunohistochemia - jest to metoda wykrywania rozmaitych substancji antygenowych w skrawkach mikroskopowych, stosowana w histopatologii i histologii. Polega na zastosowaniu przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanym składnikom preparatu a następnie systemu detekcji, tworzącego barwną, nierozpuszczalną substancję, widoczną w mikroskopie. Do związków chemicznych stosowanych do lokalizacji stosowanych w tej metodzie przeciwciał należą:

Opłaszczanie i blokowanie fazy stałej

96-dołkowa płytka (ang. Microtiter plate) służąca zwykle do przeprowadzenia testu.

Niezależnie od rodzaju przeprowadzanego badania, każdy test immunoenzymatyczny wymaga opłaszczenia fazy stałej przeciwciałem lub antygenem. Jako fazy stałej używa się zwykle płytek polistyrenowych lub pleksiglasowych ze studzienkami (dołkami), do których można dodawać niewielkie ilości roztworów. Każda studzienka pełni więc funkcję mikroprobówki, przy czym w testach ELISA używa się zwykle płytek 96-dołkowych. Oprócz płytek plastikowych możliwe jest także używanie innych materiałów, np. różnego rodzaju błon o ustalonym składzie chemicznym czy też granulek materiału magnetycznego.

Enzymy – wielkocząsteczkowe, w większości białkowe katalizatory przyspieszające specyficzne reakcje chemiczne poprzez obniżenie ich energii aktywacji.

Immunoglobuliny M (IgM) – gamma globuliny produkowane przez plazmocyty. Stanowią klasę przeciwciał zawierających łańcuch ciężki o wzorze domen: VH + CH1 + CH2 + CH3 + CH4 + ogon (przeciwciała te nie zawierają regionu zawiasowego).

Opłaszczanie z reguły przeprowadza się przez dodanie do studzienki przeciwciała lub antygenu przeznaczonego do umieszczenia na fazie stałej. Całość jest następnie inkubowana przez określony czas, najpierw zwykle w temperaturze 37 °C, a potem 4 °C, choć możliwe są także inne metody, co zależy od przeprowadzanego badania. Temperatura jest jednym z najważniejszych czynników, nie może jednak przekroczyć 56 °C, gdyż w przypadku białek dojdzie do denaturacji. Istotne znaczenie może mieć także bufor, w którym zawieszony jest czynnik stosowany do opłaszczenia fazy stałej.

Surowica krwi – produkt krzepnięcia krwi i retrakcji (rozpuszczania) skrzepu. Jej skład różni się znacząco od składu osocza. Płynna frakcja krwi pozbawiona krwinek, płytek krwi oraz fibrynogenu i czynników krzepnięcia (w przeciwieństwie do osocza surowica krwi nie krzepnie), w jej skład wchodzą natomiast rozpuszczalnej produkty konwersji fibrynogenu w fibrynę oraz składniki uwalniane z płytek krwi. Nie można zatem powiedzieć, że w skład krwi wchodzi m.in. osocze, a w skład osocza m.in. surowica.

Polistyren (-[CH2CH(C6H5)]n-) polimer z grupy poliolefin otrzymywany w procesie polimeryzacji styrenu, pochodzącego zwykle z procesu katalitycznego odwodornienia etylobenzenu (ok. 85% światowej produkcji)[potrzebne źródło], bądź z procesu Halcon-Oxirane (ok. 15% światowej produkcji)[potrzebne źródło] lub z rafinacji ropy naftowej.

Po przeprowadzeniu opłaszczenia należy jeszcze zablokować miejsca niezajęte przez przeciwciało lub antygen. Dokonuje się tego za pomocą czynników blokujących, np. roztworu owoalbuminy lub odtłuszczonego mleka, co zapobiega nieselektywnemu przyłączaniu się białek do fazy stałej podczas następnych etapów testu, wymagających także inkubacji w określonych temperaturach.

Kompleks immunologiczny (łac. complexio - połączenie, wyrównanie) - kompleks powstały przez związanie antygenu przez swoiste dla niego przeciwciało. Kompleksy takie mogą podlegać opsonizacji, fagocytozie i rozkładowi przez proteazy.

Szkło akrylowe (szkło organiczne; inaczej pleksi, pleksiglas, metapleks) – przezroczyste tworzywo sztuczne, którego głównym składnikiem jest polimer - poli(metakrylan metylu) (PMMA). Niektóre rodzaje pleksiglasu zawierają też pewne ilości innych polimerów i kopolimerów poliakrylowych.

Odmiany ELISA

"Sandwich" ELISA – test podwójnego wiązania

"Sandwich" ELISA. (1) Płytka jest pokrywana przeciwciałami specyficznymi; (2) dodawana jest próbka, i jeśli jest obecny antygen, wiąże się on do specyficznych przeciwciał; (3) antygen jest wyodrębiony z mieszaniny, po czym dodaje się przeciwciała wykrywające; (4) oraz drugorzędowe przeciwciała wyznakowane enzymem i wiążące przeciwciała wykrywające; (5) dodawany jest substrat, który jest konwertowany do wykrywalnej formy przez enzym na przeciwciałach drugorzędowych.

Ten rodzaj testu immunoenzymatycznego służy zwykle do określania stężenia danego białka (antygenu) w badanej próbce. Angielska nazwa tej metody, sandwich ELISA, czyli "kanapkowa" ELISA bierze się stąd, że antygen wiązany jest pomiędzy dwiema "warstwami" przeciwciał, co najlepiej można prześledzić, obserwując przebieg tej metody. Cyfry w nawiasach oznaczają numery zamieszczonych rysunków.

Kolorymetria - technika analityczna określania stężenia roztworów barwnych za pomocą wizualnego porównania intensywności barwy roztworu badanego z intensywnością barwy wzorca. W kolorymetrii wykorzystuje się liniową zależność absorpcji promieniowania widzialnego od stężenia roztworu (prawo Lamberta-Beera). Uważana za metodę prostą, szybką i dokładną.

Metody radioimmunologiczne (RIA -ang. Radio Immuno Assay) – metody immunochemiczne, wykrywające reakcję antygenu ze swoistym dla niego przeciwciałem w oparciu o pomiar radioaktywności izotopu promieniotwórczego, którym wyznakowany jest jeden ze składników reakcji (antygen lub przeciwciało). Służą do oznaczeń ilościowych, charakteryzują się wysoką czułością i specyficznością. RIA stosowane są do oznaczania stężenia hormonów, antygenów nowotworowych (np. CEA czy AFP), autoprzeciwciał oraz swoistych przeciwciał klasy IgE, a także innych związków, np. leków czy witamin.

Pierwszym krokiem jest umieszczenie specyficznego względem danego antygenu przeciwciała na fazie stałej, np. płytce. Po wypłukaniu przeciwciał, które nie związały się z płytką, można dodać badany materiał. Jak nietrudno zauważyć, jeśli w owym materiale znajduje się poszukiwane białko, będzie się ono łączyć do przeciwciał związanych z płytką. Widać tutaj, jak ważna jest specyficzność przeciwciała, od niej bowiem zależy, czy dany antygen zostanie związany i czy nie nastąpi sfałszowanie testu w wyniku związania innych, podobnych białek.

Rosalyn Sussman Yalow (ur. 19 lipca 1921 w Nowym Jorku) – fizyk amerykańska, laureatka Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 1977 za stworzenie radioimmunologicznych metod wykrywania białek i prace nad hormonami peptydowymi. Pierwsza kobieta, której przyznano Nagrodę Laskera za Podstawowe Badania Medyczne (w 1976).

Przeciwciała monoklonalne (mAb – ang. Monoclonal AntiBodies) – zbiór przeciwciał, które wykazują jednakową swoistość względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobne powinowactwo. Nazwa wywodzi się stąd, że wszystkie takie przeciwciała są otrzymywane z jednego klonu limfocytów B. Przeciwieństwem przeciwciał monoklonalnych są przeciwciała poliklonalne, czyli takie, które wiążą różne antygeny i względem tego samego antygenu wykazują różne powinowactwo. Analogicznie: surowica zawierająca przeciwciała monoklonalne to surowica monoklonalna, zaś surowica zawierająca przeciwciała poliklonalne to surowica poliklonalna.

Po dodaniu badanego materiału płytkę znowu się przepłukuje. Teoretycznie więc na płytce powinny pozostać jedynie przeciwciała, a jeżeli badany antygen był obecny – do niektórych przynajmniej przeciwciał powinien być przyłączony antygen.

W tej chwili antygen jest już wyodrębniony z mieszaniny, dzięki użyciu specyficznego przeciwciała, jednak osoba przeprowadzająca badanie nie jest jeszcze w stanie stwierdzić, czy tak się rzeczywiście stało. W tym celu dodawane jest kolejne przeciwciało, tym razem wyznakowane enzymem. Przeciwciało to również jest specyficzne względem poszukiwanego antygenu, jednak rozpoznaje inny region cząsteczki białkowej – dzięki temu przeciwciało użyte do wychwycenia antygenu nie blokuje przeciwciała znakowanego enzymem. Po przepłukaniu uzyskujemy strukturę "kanapki" (sandwicha), antygen rzeczywiście znajduje się pomiędzy dwiema warstwami przeciwciał. Teraz można dodać już substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem . Zwykle stosuje się związki, które w wyniku reakcji enzymatycznej przechodzą w barwny produkt. Taki test ELISA jest więc także metodą kolorymetryczną. Najczęściej stosowane enzymy to fosfataza alkaliczna (substrat: fosforan p-nitrofenolu), peroksydaza chrzanowa(substrat: tetrametylobenzydyna) oraz oksydaza glukozowa (substrat: kwas 5-aminosalicylowy). Stosując spektrofotometr można więc precyzyjnie określić natężenie barwy po określonym czasie trwania reakcji, dzięki czemu można również określić stężenie antygenu w materiale użytym do badań.

Białka – wielkocząsteczkowe (masa cząsteczkowa od ok. 10 000 do kilku mln) biopolimery, a właściwie biologiczne polikondensaty, zbudowane z reszt aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi -CONH-. Występują we wszystkich żywych organizmach oraz wirusach. Synteza białek odbywa się w specjalnych organellach komórkowych zwanych rybosomami.

Mleko – wydzielina gruczołu mlekowego uzyskana od samic ssaków w okresie laktacji. Według Międzynarodowej Federacji Mleczarskiej mleko jest to produkt całego, nieprzerwanego doju, od zdrowej, dobrze żywionej krowy mlecznej, otrzymany w sposób prawidłowy, bez domieszek siary.

Test ELISA bezpośredni i pośredni

W przedstawionym powyżej teście podwójnego wiązania, antygen po związaniu przez przeciwciała umieszczone na płytce był wykrywany przez kolejne przeciwciało, które związano ze znacznikiem (enzymem). Taką metodę wykrywania antygenu, tzn. wykrywanie go za pomocą jednego tylko przeciwciała, nazywamy bezpośrednim testem ELISA. Zaletą tej metody jest jej szybkość w porównaniu do przedstawionej dalej metody pośredniej. Warto jednak zauważyć, że test bezpośredni wymaga obecności swoistego przeciwciała, które dodatkowo musi być wyznakowane enzymem. Zatem do wykrycia innego antygenu trzeba przygotować kolejną porcję znakowanych swoistych przeciwciał, co jest kosztowne i nie zawsze możliwe do wykonania. Tych wad nie posiada test pośredni, jest on jednak bardziej pracochłonny.

Bufory – roztwory, których wartość pH po dodaniu niewielkich ilości mocnych kwasów albo zasad, jak i po rozcieńczeniu wodą prawie się nie zmienia. Roztwór buforowy to mieszanina kwasu i zasady czyli mieszanina protonodawcy i protonobiorcy według teorii Brönsteda.

Immunocytochemia – reakcja immunocytochemiczna polegająca na wykrywaniu i lokalizacji składników komórek i tkanek na zasadzie antygen-przeciwciało. Przeciwciało jest białkiem syntetyzowanym przez zwierzęta i ludzi w odpowiedzi na obecność obcej substancji zwanej antygenem. Białka te posiadają zdolność swoistego rozpoznania antygenu i wiązania się z jego determinantami (determinanta antygenowa) poprzez anty-determinantę zlokalizowaną w obrębie fragmentu Fab. Przeciwciała (zwane również immunoglobulinami) mają swoiste powinowactwo do antygenów, które wywołują ich syntezę. Białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe są efektywnymi antygenami. Grupa rozpoznawana przez przeciwciało nazywa się determinantą antygenową lub epitopem.

W przypadku pośredniego testu ELISA przeciwciało monoklonalne rozpoznające swoiście antygen (przeciwciało pierwszorzędowe, ang. primary antibody) nie jest znakowane. Znakowane jest natomiast przeciwciało drugorzędowe (ang. secondary antibody) przyłączające się do przeciwciała pierwszorzędowego, rozpoznające dany izotyp (patrz: przeciwciało) immunoglobulin.

Nagroda Nobla – wyróżnienie przyznawane za wybitne osiągnięcia naukowe, literackie lub zasługi dla społeczeństw i ludzkości, ustanowione ostatnią wolą fundatora, szwedzkiego przemysłowca i wynalazcy dynamitu – Alfreda Nobla.

Wiązanie kowalencyjne (homopolarne, atomowe) to rodzaj wiązania chemicznego. Istotą wiązania kowalencyjnego jest istnienie pary elektronów, które są współdzielone w porównywalnym stopniu przez oba atomy tworzące to wiązanie.

Jeżeli zatem do wykrycia antygenu używamy swoistego przeciwciała klasy IgG, to drugie przeciwciało musi rozpoznawać właśnie przeciwciała klasy IgG, niezależnie od tego, jaką wykazują one specyficzność. Zaletą tej metody jest to, że nie trzeba znakować specyficznych względem antygenu przeciwciał. Pozwala to na użycie różnych przeciwciał pierwszorzędowych, bez potrzeby dodatkowych manipulacji związanych z ich znakowaniem, po czym przeciwciała te mogą zostać wykryte za pomocą zawsze takich samych przeciwciał znakowanych. Poniższy rysunek pokazuje różnice między bezpośrednim (1) i pośrednim (2) testem ELISA (jest to już wynik końcowy, bez ukazywania kolejnych kroków):

Antygen (gr. ἀντί anti - przeciw, γένος genos - ród, rodzaj; przytaczane także ang. antigen = antibody generator, generator przeciwciał) każda substancja, która wykazuje dwie cechy: immunogenność, czyli zdolność wzbudzenia przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej swoistej, oraz antygenowość, czyli zdolność do reagowania z przeciwciałami oraz TCR.

Wykrywanie swoistych przeciwciał testem ELISA

Wspomniany już test podwójnego wiązania służy do wykrywania danego antygenu za pomocą przeciwciał. Sytuację można jednak odwrócić i wykryć przeciwciało za pomocą danego antygenu, co ma duże znaczenie w diagnostyce (np. wykrywanie przeciwciał anty-HIV w przypadku badań na obecność tego wirusa w organizmie chorego). W odróżnieniu jednak od testu podwójnego wiązania, wykrywanie przeciwciał można wykonać jedynie testem pośrednim.

Wykrycie przeciwciał metodą ELISA

W celu wykrycia przeciwciał należy opłaszczyć fazę stałą antygenem (1), przeciwko któremu skierowane są poszukiwane przeciwciała. W przypadku zastosowań diagnostycznych dostępne są zwykle gotowe, opłaszczone antygenem płytki. Na tak przygotowane podłoże nanosi się surowicę pacjenta i po odpowiednim czasie inkubacji płytkę się przepłukuje. Jeżeli przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi znajdowały się w surowicy, zwiążą się one z antygenem na płytce (2). Za pomocą drugiego przeciwciała lub innego wyznakowanego ligandu można nie tylko wykryć przeciwciała, ale nawet określić ich klasę (3,4), co może dostarczyć dodatkowych informacji o chorobie lub danych epidemiologicznych (np. obecność tylko przeciwciał IgM świadczy o tym, że chory przechodzi pierwsze w życiu zakażenie danym drobnoustrojem, zaś obecność IgG świadczy o kolejnym zakażeniu).

Kompetycyjny test ELISA

W kompetycyjnych (rywalizacyjnych) testach ELISA (c-ELISA, z ang. competitive ELISA) wykorzystuje się mieszankę znakowanego antygenu lub przeciwciała, które są dodawane do badanego materiału. Rozpatrzmy najpierw przypadek oznaczania stężenia przeciwciał w surowicy przeciwko danemu antygenowi. Podobnie jak w ELISA mierzących stężenie przeciwciał, faza stała jest opłaszczona odpowiednim antygenem. Jeśli na fazę stałą podziałamy teraz mieszanką badanej surowicy i specyficznego względem danego antygenu przeciwciała monoklonalnego wyznakowanego enzymem, to nastąpi współzawodnictwo pomiędzy przeciwciałami w surowicy, a przeciwciałem znakowanym. Jak nietrudno zauważyć, w odróżnieniu od poprzednich metod natężenie reakcji enzymatycznej będzie odwrotnie proporcjonalne do stężenia przeciwciał w surowicy, gdyż im większe będzie ich stężenie, tym mniej znakowanego przeciwciała przyłączy się do antygenu umieszczonego na fazie stałej.

Stosowana jest również alternatywna metoda, w której faza stała jest opłaszczona przeciwciałem, natomiast rywalizacja o miejsca wiążące przeciwciał zachodzi między standaryzowanym, wyznakowanym antygenem, a antygenem zawartym w badanym materiale. Podobnie jak w wersji ze znakowanym przeciwciałem, także tutaj sygnał jest odwrotnie proporcjonalny do stężenia badanego antygenu.

Zobacz też

test immunofluorescencyjny,

immunocytochemia,

immunohistochemia

Zapoznaj się z zastrzeżeniami dotyczącymi pojęć medycznych i pokrewnych w Wikipedii.