Sekwencjonowanie DNA - Polski Serwis Naukowy

Sekwencjonowanie DNA – technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA.

Sekwencjonowanie dokonuje się obecnie głównie za pomocą zautomatyzowanych sekwencjonatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów lub podczas ćwiczeń.

Przykład sekwencji DNA (początek operonu laktozowego E. coli z GenBank):

GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG

gdzie: A – deoksyadenozyna; C – deoksycytydyna; G – deoksyguanozyna; T – tymidyna

Metody historyczne

Sekwencjonowania DNA metodą Sangera z użyciem znakowanych dideoksynukleotydów
A – przykładowa sekwencja DNA
B – przyłączenie startowego oligonukleotydu do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA
C – produkty syntezy DNA, zakończone fluorescencyjnie znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)
D – elektroforegram rozdziału otrzymanej mieszaniny fragmentów w elektroforezie kapilarnej wraz z zidentyfikowaną sekwencją (powyżej)

Przykładowy pirogram uzyskany z pirosekwencjonowania

Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w 1977 r. metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduję ich segregację pod względem wielkości.

Tranzystor polowy DNA (skrót ang. DNAFET) to tranzystor polowy wykorzystujący efekt polowy ładunków w DNA cząsteczce. Taki tranzystor pełni funkcję biosensora lub może być wykorzystywany do odczytu równoległych obliczeń z wykorzystaniem masowej hybrydyzacji ssDNA.

X Prize Foundation to organizacja non-profit fundująca nagrody w celu stymulacji publicznego współzawodnictwa. Organizacja ogłosiła przyznanie nagród (po 10 mln dolarów amerykańskich) za osiągniecie wymaganych kryteriów w różnych dziedzinach nauki i techniki.

Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli Walter Gilbert i Allan Maxam (metoda Maxama-Gilberta). Gilbert wraz z Frederickiem Sangerem otrzymali za to osiągnięcie nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.

Kapilara – bardzo cienka rurka, tak cienka, że praktycznie cała ciecz przepływająca przez nią znajduje się w polu oddziaływania sił związanych jej ściankami i cieczy bezpośrednio przylegającej do ścianek, w wyniku czego prędkość poruszania się cząsteczek silnie zależy od odległości od ścianek (profil paraboliczny).

Para zasad (pz lub bp z (ang.) base pair) - w biologii molekularnej - komplementarne, połączone wiązaniami wodorowymi zasady azotowe nukleotydów dwóch różnych nici kwasu nukleinowego. W parach zasad podaje się długość cząsteczek DNA.

Metody współczesne

Obecnie odczyt sekwencji w metodzie Sangera został zautomatyzowany dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej kapilary lub linii na żelu.

Nowoczesne masowo równoległe aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów par zasad na godzinę. Tranzystory polowe DNA umożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do mikromacierzy i odczyt w czasie rzeczywistym.

Nagroda Archon Genomics X PRIZE w wysokości 10 mln dolarów czeka na ośrodek, który będzie w stanie zsekwencjonować 100 genomów ludzkich w ciągu 10 dni. Pierwsze sekwencjonowanie genomu człowieka zajęło wiele lat (zob. Projekt poznania ludzkiego genomu).

In vitro (łac. w szkle) – termin stosowany przy opisywaniu badań biologicznych, oznacza procesy biologiczne przeprowadzane w warunkach laboratoryjnych, poza organizmem.

Enzymy – wielkocząsteczkowe, w większości białkowe katalizatory przyspieszające specyficzne reakcje chemiczne poprzez obniżenie ich energii aktywacji.

Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w Projekcie Genograficznym. Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in. genetyki genealogicznej oraz wielu rodzajów badań testujących obecność mutacji.

Genom – materiał genetyczny zawarty w podstawowym (haploidalnym) zespole chromosomów. Termin mylony jest z genotypem, czyli całością informacji genetycznej zawartej w chromosomach organizmu.

Francis Harry Compton Crick (ur. 8 czerwca 1916 roku w Northampton, Anglia, Wielka Brytania, zm. 28 lipca 2004, w San Diego, Kalifornia, Stany Zjednoczone) – angielski biochemik, genetyk i biolog molekularny, który wraz z Jamesem D. Watsonem i Rosalindą Franklin odkrył strukturę molekularną kwasu deoksyrybonukleinowego DNA. Pracownik naukowy Laboratorium Biologii Molekularnej na Uniwersytecie Cambridge, członek Towarzystwa Królewskiego w Londynie.

Metody rozwojowe

pirosekwencjonowanie; jego wersja "sekwencjonowanie 454" pozwala odczytać 300 MBp na dzień w jednej maszynie. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.

bezpośredniego odczytu:

nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. Szybkość takiego odczytu może dochodzić od 300 Bp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika.

mikroskopowe

Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA

1953 – opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka

1972 – opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację.

1977 – Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt. Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie.

1980 – Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali nagrodę Nobla

1982 – utworzono Genbank – publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA

Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA

1982 – Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi.

1984 – badacze z MRC odczytali kompletną sekwencję wirusa Epstein-Barr, 170 kb.

1997 – zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii Escherichia coli.

2001, 15 lutego – Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature.

2001, 16 lutego – firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science.

Zobacz też

sekwencjonowanie białka

Przypisy

Sanger, F, Nicklen, S, Coulson, AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 74. 12, s. 5463–5467, 1977. PMID 431765.
A M Maxam and W Gilbert, A new method for sequencing DNA, Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 February; 74(2): 560–564.
ogłoszenie o konkursie X Prize Foundation (ang.)
http://visigenbio.com/technology_overview.html