Spektrometria mas - Polski Serwis Naukowy

Spektrometria mas (MS, Mass Spectrometry) – uniwersalna technika analityczna, zaliczana do metod spektroskopowych, której podstawą jest pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego danego jonu.

Pierwszy spektrometr mas został zbudowany przez J. J. Thompsona w 1911 roku. Współcześnie istnieje wiele odmian tej techniki, z których każda posiada inne zastosowanie i wymaga stosowania aparatów o innej konstrukcji. Wszystkie te techniki są jednak oparte na jonizacji cząsteczek lub atomów, a następnie detekcji liczby jonów w funkcji ich stosunku masy do ładunku (m/z). Wyniki działania spektrometru mas są przedstawiane w postaci tzw. widma masowego.

Spektroskopia – nauka o powstawaniu i interpretacji widm powstających w wyniku oddziaływań wszelkich rodzajów promieniowania na materię rozumianą jako zbiorowisko atomów i cząsteczek. Spektroskopia jest też często rozumiana jako ogólna nazwa wszelkich technik analitycznych polegających na generowaniu widm.
Cząsteczka, inaczej molekuła – obojętne elektrycznie indywiduum chemiczne, złożone z więcej niż jednego atomu, które są ze sobą trwale połączone wiązaniami chemicznymi.

Spektrometria mas służy do:

identyfikacji związków chemicznych i ich mieszanin,

ustalania struktury związków chemicznych,

ustalania ich składu pierwiastkowego,

ustalania składu izotopowego analizowanych substancji, co m.in. umożliwia określenie ich źródła pochodzenia

precyzyjnego ustalania składu złożonych mieszanin związków o wysokich masach molowych w proteomice, badaniach materiałowych i chemii polimerów.

Niezależnie od konstrukcji i przeznaczenia, we wszystkich spektrometrach mas występują następujące elementy:

Gaz – stan skupienia materii, w którym ciało fizyczne łatwo zmienia kształt i zajmuje całą dostępną mu przestrzeń. Właściwości te wynikają z własności cząsteczek, które w fazie gazowej mają pełną swobodę ruchu. Wszystkie one cały czas przemieszczają się w przestrzeni zajmowanej przez gaz i nigdy nie zatrzymują się w jednym miejscu. Między cząsteczkami nie występują żadne oddziaływania dalekozasięgowe, a jeśli, to bardzo słabe. Jedyny sposób, w jaki cząsteczki na siebie oddziałują, to zderzenia. Oprócz tego, jeśli gaz jest zamknięty w naczyniu, to jego cząsteczki stale zderzają się ze ściankami tego naczynia, wywierając na nie określone i stałe ciśnienie.
Atom (z gr. ἄτομος atomos: "niepodzielny") – najmniejszy składnik materii, któremu można przypisać właściwości chemiczne. Atomistyczną teorię budowy materii sformułował w roku 1808 John Dalton.

Schemat ideowy zasady działania spektrometru mas

źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji,

analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku.

detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.

Puszka Faradaya - jest to metalowa komora otwarta z jednej strony, rodzaj klatki Faradaya, przeznaczona do doświadczeń i prac nad ładunkami elektrycznymi. Ciało naelektryzowane, przewodzące prąd elektryczny wprowadzone do wnętrza puszki po dotknięciu ścianki puszki oddaje całkowicie swój ładunek elektryczny (przestaje być naelektryzowane) puszce.
Doping wydolnościowy – sztuczne podnoszenie wydolności fizycznej i psychicznej zawodnika metodami wykraczającymi poza normalny, "naturalny" trening, choć w praktyce granica między dopingiem i treningiem jest często bardzo trudna do ustalenia. Ogólnie za doping uważa się metody medyczne, potencjalnie szkodliwe dla zdrowia, które zostały oficjalnie zabronione.

Budowa i działanie spektrometru mas

Działanie tradycyjnego spektrometru mas opiera się na odchylaniu strumienia jonów badanej substancji w polu elektrycznym. Wszystkie cząsteczki analizowane w spektrometrze mas muszą mieć ładunek elektryczny. Wewnątrz spektrometru mas panuje próżnia, dzięki czemu ruch jonów nie jest zakłócany przez zderzenia z cząsteczkami gazów.

John Bennett Fenn (ur. 15 czerwca 1917 w Nowym Jorku) - chemik amerykański, laureat Nagrody Nobla 2002. Studiował w Berea College w Berea (Kentucky), doktorat obronił na Uniwersytecie Yale. Przez wiele lat pracował w Yale, następnie był profesorem na Virginia Commonwealth University w Richmond (Wirginia).
Chromatografia (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.

Pierwszym przedziałem spektrometru mas jest źródło jonów. Urządzenie to przeprowadza substancje analizowane w spektrometrze w jony unoszące się w fazie gazowej. Zjonizowane cząsteczki przechodzą do dalszych przedziałów spektrometru mas, gdzie formowana jest wiązka jonów. Wiązka ta jest kierowana do analizatora masy.

Półprzewodniki - najczęściej substancje krystaliczne, których konduktywność (przewodnictwo właściwe) może być zmieniana w szerokim zakresie (np. 10-8 do 106 S/m (simensa na metr)) poprzez domieszkowanie, ogrzewanie, oświetlenie badź inne czynniki. Przewodnictwo typowego półprzewodnika plasuje się między przewodnictwem metali i dielektryków.
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (FT-ICR, Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) to analizator jonów, element konstrukcji niektórych spektrometrów mas.

Analizator masy rozdziela jony ze względu na stosunek ich masy do ładunku. Jony kierowane są do detektora, który zamienia w sposób ilościowy sygnał w postaci prądu jonowego na sygnał elektryczny, który jest rejestrowany przez komputer w postaci widma stosunku masy do ładunku elektrycznego (nazywanego często widmem masowym). W widmie takim na osi poziomej odłożone są stosunki mas do ładunków w thompsonach (1 Th = 1 dalton / liczba ładunków elementarnych jonu), na osi pionowej intensywności (liczba jonów zarejestrowanych przez spektrometr).

Foton (gr. φως – światło, w dopełniaczu – φοτος) jest cząstką elementarną nie posiadającą ładunku elektrycznego ani momentu magnetycznego, o masie spoczynkowej równej zero (m0 = 0), liczbie spinowej s = 1 (fotony są zatem bozonami). Fotony są nośnikami oddziaływań elektromagnetycznych, a ponieważ wykazują dualizm korpuskularno-falowy są równocześnie falą elektromagnetyczną.
Wiązanie chemiczne według klasycznej definicji to każde trwałe połączenie dwóch atomów. Wiązania chemiczne powstają na skutek uwspólnienia dwóch lub więcej elektronów pochodzących bądź z jednego, bądź z obu łączących się atomów lub przeskoku jednego lub więcej elektronów z jednego atomu na atom i utworzenia w wyniku tego tzw. pary jonowej.

Typowy przykład widma masowego. Widmo masowe mieszaniny peptydów wykonane przy pomocy spektrometru mas ESI-Q-TOF (spektrometr tandemowy z jonizacją typu electrospray i dwoma analizatorami – kwadrupol i TOF). Oś pozioma:stosunek masy (m) do ładunku (z) jonu. Oś pionowa: liczba zliczeń danego jonu przez detektor

Określanie masy cząsteczek

Ze stosunku masy do ładunku jonu można zwykle wywnioskować, jaka była masa cząsteczkowa analizowanego związku chemicznego lub jego fragmentu. Metody jonizacji w niektórych spektrometrach mas są tak dobrane, aby ładunek (z) był dla większości jonów równy 1, a zatem przy interpretacji widma można przyjąć, że m/z odpowiada po prostu masie cząsteczkowej jonu. Warto zauważyć, że masa cząsteczkowa jednokrotnie naładowanego jonu jest w przybliżeniu równa masie cząsteczkowej niezjonizowanej substancji tylko wtedy, gdy jonizacja jest dokonywana przez dołączenie elektronu (ze względu na bardzo małą masę elektronu). Jeśli do cząsteczki dołączany jest proton, to masa jonu jest większa od masy substancji niezjonizowanej o masę protonu (1,00727646688 Da).

Mocz (łac. urina) - uryna, płyn wytwarzany w nerkach i wydalany z organizmu, zawierający produkty przemiany materii bezużyteczne lub szkodliwe dla ustroju.
Pułapka jonowa - rodzaj analizatora jonów, element konstrukcyjny niektórych spektrometrów mas. Pułapki jonowe charakteryzują się zwykle niewielką rozdzielczością (rzędu 1000 daltonów) oraz bardzo dużą czułością.

Dokładną masę badanego, wyjściowego związku chemicznego, na podstawie miejsca występowania sygnału powstałego z jego niepofragmentowanego jonu w widmie można obliczyć według wzoru: $m_{zw} = (m/z) * z - m_{cz}$ gdzie: mzw – masa wyjściowej cząsteczki, która ulegała jonizacji bez fragmentacji m/z – wartość odczytana z dobrze skalibrowanego widma dla niepofragmentowanego jonu, odpowiadająca stosunkowi masy analizowanej cząsteczki w daltonach do liczby ładunków elementarnych (z) które niósł z sobą jon, który wygenerował analizowany sygnał; mcz – suma mas cząstek lub jonów, które nadały ładunek poprzez przyłączenie się do wyjściowej cząsteczki w daltonach, (protonu – 1,00727646688 Da; elektronu około 0,00054862 Da). Jeśli jonizacja następuje na skutek oderwania cząstki to należy podstawić jej masę ze znakiem minus.

Jeżeli cząstką dołączaną lub odrywaną jest elektron, jego masę można pominąć (uproszczony wzór: $m = (m/z) * z$ ).

The University of Cambridge (nieformalnie: Cambridge University, po polsku Uniwersytet Cambridge lub po prostu Cambridge) - drugi po Oxfordzie najstarszy angielski uniwersytet, założony w roku 1209. Znajduje się w Cambridge w środkowej Anglii. Jest on uważany za jeden z najlepszych uniwersytetów w Europie i na świecie. Uniwersytety Oksfordzki i Cambridge określane są wspólną nazwą Oxbridge.
Izotopy – odmiany pierwiastka chemicznego różniące się liczbą neutronów w jądrze atomu (z definicji atomy tego samego pierwiastka mają tę samą liczbę protonów w jądrze). Izotopy tego samego pierwiastka różnią się liczbą masową (łączną liczbą neutronów i protonów w jądrze), ale mają tę samą liczbę atomową (liczbę protonów w jądrze).

Przykładowo na przedstawionym wyżej diagramie pik odpowiadający m/z = 435,776 Th może pochodzić od:

jonu posiadającego jeden ładunek elementarny powstałego przez oderwanie elektronu z cząsteczki o masie 435,776 Da (masa elektronu jest pomijalnie mała)

jonu posiadającego jeden ładunek elementarny powstały przez przyłączenie jednego protonu, który powstał z cząsteczki o masie 435,776 − 1,007 = 434,769

jonu posiadającego dwa ładunki elementarne, który powstał przez oderwanie dwóch elektronów z cząsteczki o masie 435,776 * 2 = 871,552 Da (ponownie masę elektronów można zignorować)

jonu posiadającego dwa ładunki elementarne na skutek oderwania jednego elektronu i przyłączenia jednego protonu, pochodzącego z cząsteczki o masie 435,776 * 2 − 1,007 = 870,545 Da

jonu posiadającego dwa ładunki elementarne na skutek przyłączenia dwóch protonów, pochodzącego od cząsteczki o masie 435,776 * 2 − 1,007 * 2 = 869,538 Da

Jak widać, ustalenie dokładnej masy analizowanego związku nie jest oczywiste nawet z użyciem technik jonizacji nie prowadzących do fragmentacji. Znając warunki jonizacji oraz analizując całe widmo można jednak w pokazanym przykładzie odrzucić większość hipotez źródła sygnału 435,776. W warunkach jonizacji przez elektrorozpylanie, która była zastosowana do otrzymania omawianego widma, powstanie jonu posiadającego dwa ładunki elementarne jest najbardziej prawdopodobne na skutek oderwania jednego elektronu i przyłączenia jednego protonu. W widmie występuje też pik przy wartości 870,553 Th, który najprawdopodobniej pochodzi od cząsteczki o masie 870,553 Da. Przeciwko hipotezie, że pik przy wartości 435,776 Th pochodzi od jonu o podwójnym ładunku utworzonego z cząsteczki o masie 870,553 Da przemawia fakt zbyt niskiej intensywności piku 870,553 w stosunku do 435,776. Zwykle intensywność piku od jonu z jednym ładunkiem elementarnym w stosunku do odpowiedniego jonu z dwoma ładunkami, jest w technice elektrorozpylania jak 2:1 albo więcej. Ostatecznie więc można przyjąć z dużym prawdopodobieństwem, że pik 435,776 Th pochodzi najprawdopodobniej od jonu, który powstał ze związku o masie 435,776 Da.

Fluorescencja – jeden z rodzajów luminescencji – zjawiska emitowania światła przez wzbudzony atom lub cząsteczkę. Zjawisko uznaje się za fluorescencję, gdy po zaniku czynnika pobudzającego następuje szybki zanik emisji w czasie około 10−8 s. Gdy czas zaniku jest znacznie dłuższy, to zjawisko jest uznawane za fosforescencję.
HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography – wysokosprawna chromatografia cieczowa) – to technika analityczna a także preparatywna, stosowana do badania czystości, oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych.

Obwiednia izotopowa

Większość pierwiastków chemicznych występuje w przyrodzie w postaci kilku izotopów. Zwykle jeden izotop dominuje, pozostałe występują w mniejszej ilości. Różnice w masie cząsteczek powodowane przez występowanie izotopów są widoczne na widmach masowych, co oznacza, że sygnały od jednego związku chemicznego lub jego fragmentu występują na widmie w formie kilku pików.

Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk został utworzony w 1957 roku. Prowadzone są w nim różnorodne badania z zakresu biologii molekularnej, biochemii, biofizyki, genomiki, proteomiki, transkryptomiki. Siedziba Instytutu znajduje się w Warszawie przy ulicy Pawińskiego 5a w obrębie Kampusu Ochota.
Jon – atom lub grupa atomów połączonych wiązaniami chemicznymi, która ma niedomiar lub nadmiar elektronów w stosunku do protonów. Obojętne elektrycznie atomy i cząsteczki związków chemicznych posiadają równą liczbę elektronów i protonów, jony zaś są elektrycznie naładowane dodatnio lub ujemnie.

Obwiednia izotopowa peptydu o masie 859,5 Da zarejestrowana spektrometrem Q-TOF. Pierwszy pik to pik monoizotopowy. W piku tym występują tylko atomy dominujących izotopów. W cząsteczkach tworzących pik drugi występuje po jednym atomie izotopu cięższego o 1 Da od izotopu dominującego. W trzecim piku występują dwa takie atomy, a w czwartym – trzy.

Wymiana jednego atomu izotopu lżejszego na cięższy w cząsteczce zmienia jej masę o różnicę między masami tych izotopów. Gdy zatem występują cząsteczki, które różnią się tylko jednym izotopem, są one widoczne w widmie w postaci dwóch pików. Gdy uwzględnić dwa izotopy jednego atomu lub izotopy dwóch atomów, w związku chemicznym występować mogą już cząsteczki, o trzech różnych masach, co prowadzi do trzech sygnałów w widmie masowym. W przypadku dużych cząsteczek, takich jak białka możliwa jest obserwacja nawet kilkudziesięciu pików izotopowych. Charakterystyczny wzór pików (lub kształt jednego piku powstałego ze zlania sygnałów) pochodzących od różnych form związku chemicznego zawierającego atomy różnych izotopów nazywany jest obwiednią izotopową. Dla określenia charakterystycznego wzoru pików izotopowych używa się także terminu rozkład izotopowy.

Hel (He, łac. helium) – pierwiastek chemiczny, z grupy gazów szlachetnych w układzie okresowym. Jest po wodorze drugim najbardziej rozpowszechnionym pierwiastkiem chemicznym we wszechświecie, jednak na Ziemi występuje wyłącznie w śladowych ilościach (4·10-7% w górnych warstwach atmosfery).
Spektroskopia NMR, Spektroskopia Magnetycznego Rezonansu Jądrowego ( – jedna z najczęściej stosowanych obecnie technik spektroskopowych w chemii i medycynie.

Wiedząc jaka jest różnica pomiędzy masami podstawowych izotopów pierwiastków występujących w związku chemicznym można określić liczbę ładunków elementarnych poszczególnych jonów. Najczęściej, różnica masy pomiędzy kolejnymi izotopami jednego pierwiastka wynosi 1 Da, a zatem jeśli w widmie występują sygnały o różnicach 1 Th, sugeruje to, że analizowany jon posiadał pojedynczy ładunek elementarny. Jeśli różnica między bliskimi sobie pikami izotopowymi wynosi 0,5 Th to znaczy to, że cała seria sygnałów w ramach tej obwiedni pochodzi od jonów, które miały podwójny ładunek elementarny.

Kelwin – jednostka temperatury w układzie SI równa 1/273,16 temperatury termodynamicznej punktu potrójnego wody, oznaczana K. Definicja ta odnosi się do wody o następującym składzie izotopowym: 0,00015576 mola 2H na jeden mol 1H, 0,0003799 mola 17O na jeden mol 16O i 0,0020052 mola 18O na jeden mol 16O[1].
Proton, p <(gr.) πρῶτον – "pierwsze" (l.poj., rodz. nijaki)> - trwała cząstka elementarna z grupy barionów o ładunku +1 i masie spoczynkowej równej ok. 1 u. Protony są głównym składnikiem pierwotnego promieniowania kosmicznego. Protony wraz z neutronami (→ nukleony) tworzą jądra atomowe pierwiastków chemicznych. Liczba protonów w jądrze danego atomu jest równa jego liczbie atomowej, która z kolei jest podstawą uporządkowania atomów w układzie okresowym pierwiastków.

Ogólnie, w ramach jednej obwiedni ładunek jest w przybliżeniu równy wielokrotności masy neutronu (ok 1), kolejne piki są położone m/z kolejnych pików izotopowych. Gdy w jednym obszarze widma występują zarówno sygnały których różnica wynosi 1 i 0,5 Th, wskazuje to na fakt nałożenia na siebie dwóch lub więcej obwiedni izotopowych, pochodzących od dwóch lub więcej zestawów jonów, różniących się masą dwukrotnie. Takie sytuacje zdarzają się szczególnie często w analizach MALDI/TOF badających cząstki znacznie różniące się masą z niejednorodnych mieszanin polimerów.

Pole elektryczne – stan przestrzeni otaczającej ładunki elektryczne lub zmienne pole magnetyczne. W polu elektrycznym na ładunek elektryczny działa siła elektrostatyczna.
Kapilara – bardzo cienka rurka, tak cienka, że praktycznie cała ciecz przepływająca przez nią znajduje się w polu oddziaływania sił związanych jej ściankami i cieczy bezpośrednio przylegającej do ścianek, w wyniku czego prędkość poruszania się cząsteczek silnie zależy od odległości od ścianek (profil paraboliczny).

Gdy warunki jonizacji pozwalają na tworzenie się jonów pochodzących od strukturalnie jednakowych fragmentów cząsteczki o dwóch różnych ładunkach, to wówczas w widmie widoczne są dwie lub więcej obwiednie izotopowe dla tych fragmentów, co bardzo komplikuje analizę widma. Z tego względu większość technik jonizacji stara się zapobiegać tego rodzaju sytuacji.

Kwasy nukleinowe - biopolimery zbudowane z nukleotydów. Zasadniczo są dwa rodzaje kwasów nukleinowych: kwas rybonukleinowy (RNA) oraz kwas deoksyrybonukleinowy (DNA). Oba mogą występować pod postacią zarówno pojedynczej jak i podwójnej nici, przy czym zazwyczaj DNA tworzy nić podwójną, a RNA pojedynczą.
Próżnia – w rozumieniu tradycyjnym pojęcie równoważne pustej przestrzeni. We współczesnej fizyce, technice oraz rozumieniu potocznym pojęcie próżni posiada zupełnie odmienne konotacje.

Większość związków organicznych, w których dominują atomy węgla, stosuje się do tej reguły i ułatwia rozpoznanie w widmie jonów wielokrotnie zjonizowanych. Wynika to z występowania węgla C12 i C13 różniących się masą o jeden Da. W przypadku gdy w związku występują znaczne ilości atomów pierwiastków posiadających izotopy różniące się masą o 2 i więcej daltonów (np.: chlor), wówczas analiza obwiedni izotopowych bardzo się komplikuje. Na podstawie charakterystycznej obwiedni izotopowej można często wnioskować o składzie pierwiastkowym badanego związku chemicznego. Tego typu analizy przeprowadza się zazwyczaj przy pomocy specjalistycznych programów komputerowych.

Liniowa pułapka jonowa (Linear Ion Trap, Linear Trap Quadrupole - LTQ) – odmiana kwadrupolowego analizatora masy, w którym elektrody są czterema równoległymi prętami. Na obu końcach analizatora przykładany jest potencjał elektryczny, który uniemożliwia ucieczkę jonów z analizatora.
Pole elektromagnetyczne - pole fizyczne, stan przestrzeni w której na obiekt fizyczny mający ładunek elektryczny działają siły o naturze elektromagnetycznej. Pole elektromagnetyczne jest układem dwóch pól: pola elektrycznego i pola magnetycznego. Pola te są wzajemnie związane a postrzeganie ich zależy też od obserwatora, wzajemną relację pól opisują równania Maxwella. Własności pola elektromagnetycznego, jego oddziaływanie z materią bada dział fizyki zwany elektrodynamiką. W mechanice kwantowej pole elektromagnetyczne jest postrzegane jako wirtualne fotony.

Rozdzielczość spektrometru mas. Niebieskie linie ilustrują jak wyglądałoby widmo zmierzone przez analizator o nieskończonej rozdzielczości. Linie zielona i czerwona – widmo zmierzone przez analizatory o rozdzielczości 200 i 2000

Rozdzielczość spektrometru mas

Rozdzielczość jest jednym z najważniejszych parametrów charakteryzujących spektrometr mas. Miarą rozdzielczości spektrometru jest zdolność do rozróżnienia dwóch jonów o pewnej różnicy stosunku masy do liczby ładunków elementarnych jonów (m/z). Spektrometr o rozdzielczości 1000 będzie umożliwiał rozróżnienie dwóch cząsteczek o m/z równym 1000 i 1001. Można przyjmować różne kryteria pomiaru rozdzielczości. Najczęściej uznaje się, że jeśli na widmie m/z dolina pomiędzy pikami dwóch jonów jest głębsza niż 50% wysokości pików, to są one rozróżnione.

Biologia molekularna – nauka podstawowa zajmująca się biologią na poziomie molekularnym. Bada, w jaki sposób funkcjonowanie organizmów żywych uwarunkowane jest właściwościami budujących je cząsteczek, a zwłaszcza biopolimerów, jakimi są kwasy nukleinowe i białka. Zazębia się ona z takimi dziedzinami wiedzy jak genetyka, biochemia, biofizyka czy cytologia.
Biopolimery - polimery występujące naturalnie w organizmach żywych, które są przez nie produkowane. Znaczna część związków organicznych występujących w tych organizmach to właśnie biopolimery. Wchodzą w skład komórek, są też budulcem w obszarach międzykomórkowych. Szczególnie ważną rolę pełnią biopolimery, które mają wiele grup funkcyjnych.

Rozdzielczość nie jest zależna tylko od konstrukcji analizatora masy. Na rozdzielczość pomiaru wpływa wiele czynników. Często w ramach jednego widma obserwuje się piki od jonów zarejestrowanych z różną rozdzielczością.

Techniki jonizacji

Istnieje wiele metod jonizacji cząsteczek w spektrometrach mas. Do metod najczęściej używanych należą:

Jonizacja elektronami (Electron Ionisation – EI) – jonizacja przy pomocy wiązki elektronów. Jonizacja odbywa się w próżni. Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych cząsteczek. EI charakteryzuje się stosunkowo małą wydajnością – poniżej 1% cząsteczek ulega jonizacji.

Elektrorozpylacz w spektrometrze mas LTQ-FTICR. Własność IBB PAN

Elektrorozpylanie (Electrospray, ESI), polegające na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną substancję z igły, do której przyłożono wysokie napięcie (zwykle 1–5 kV) pod ciśnieniem atmosferycznym. Jest to jedna z łagodnych metod jonizacji – zwykle nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad wielkocząsteczkowymi biopolimerami takimi jak białka i oligonukleotydy.

Termorozpylanie (Termospray, TE) – jonizacja przez podgrzanie przy pomocy prądu elektrycznego roztworu zawierającego sól i analizowaną substancję wewnątrz stalowej kapilary. Gorąca substancja jest rozpylana w komorze próżniowej z prędkością naddźwiękową.

Jonizacja chemiczna (Chemical Ionisation, CI) – jony wytwarzane są na skutek zderzeń cząsteczek badanego związku chemicznego z jonami pierwotnymi obecnymi w źródle jonów. Jest to metoda nie powodująca fragmentacji cząsteczek (łagodna jonizacja). Jonizacja odbywa się zwykle przy ciśnieniu rzędu 60 Pa.

Bombardowanie szybkimi atomami (Fast-Atom Bombardment FAB), polegającą na bombardowaniu cząsteczki obojętnymi atomami o wysokiej energii (zwykle 17 lub 70 eV). Cząsteczki mogą znajdować się w fazie gazowej lub być rozpuszczone w ciekłej, mało lotnej substancji (matrycy) np. glicerolu.

Bombardowanie jonami (spektrometria mas jonów wtórnych – Secondary Ion Mass Spectrometry – SIMS) Metoda ta początkowo była stosowana do substancji przewodzących prąd lub substancji naniesionych na metalowe płytki. Obecnie metodę SIMS stosuje się z powodzeniem do substancji nie przewodzących prądu. Istnieje odmiana techniki SIMS, w której badana substancja jest rozpuszczona w ciekłej matrycy (najczęściej glicerolu). Technika ta jest nazywana czasami LSIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) lub FIB (Fast Ion Bombardment).

Desorpcja laserowa (Laser Desorption – LD) – w której jonizacja następuje przez naświetlanie próbki silnym laserem, a zatem bombardującymi cząstkami są wysokoenergetyczne fotony.

Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – MALDI) – w której stosuje się jonizację laserową, ale z tak dobraną energią wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do ich "wybijania" ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca absorbuje energię lasera, która jest później przekazywana do analizowanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad biopolimerami i polimerami syntetycznymi.

Plazma wzbudzona indukcyjnie (ICP) – jonizowana substancja jest wprowadzana do plazmy płomienia palnika znajdującego się w kwarcowej rurze. Rura otoczona jest cewką, przez którą przepływa prąd zmienny o wysokiej częstotliwości. Plazma ogrzewa się do temperatury rzędu 10 000 K w wyniku wzbudzenia polem magnetycznym wytworzonym przez prąd płynący w cewce. Metoda nadaje się doskonale do analizy pierwiastków metalicznych.

Wiele metod jonizacji cząsteczek takich jak FAB, EI i LD prowadzi do fragmentacji cząsteczek chemicznych w trakcie jonizacji, co powoduje, że różne spektrometry mogą generować różne widma dla tego samego związku chemicznego. Fragmentacja cząsteczek może pomagać w analizie, gdy badany jest jeden związek chemiczny. Pomiar masy takiego związku często nie wystarcza do jego identyfikacji, na którą pozwala analiza charakterystycznego wzoru fragmentacji takiego związku. W przypadku mieszanin wielu związków chemicznych, wtórne reakcje między jonami pochodzącymi z różnych związków, uniemożliwiają praktyczną analizę danych.

Krew (łac. sanguis, gr. αἷμα, haima) – płyn ustrojowy, który za pośrednictwem układu krążenia pełni funkcję transportową, oraz zapewnia komunikację pomiędzy poszczególnymi układami organizmu. Krew jest płynną tkanką łączną, krążącą w naczyniach krwionośnych (układ krwionośny zamknięty) lub w jamie ciała (układ krwionośny otwarty). W szerokiej definicji obejmuje krew obwodową i tkankę krwiotwórczą, a w wąskiej tylko tę pierwszą. Jako jedyna (wraz z limfą) występuje w stanie płynnym. Dziedzina medycyny zajmująca się krwią to hematologia.
Chromatografia gazowa to analityczna technika chromatograficzna, w której fazą nośną jest gaz (najczęściej hel, argon, coraz rzadziej wodór). Technika ta umożliwia procentowe ustalenie składu mieszanin związków chemicznych, w których występuje ich nawet kilkaset. Stosując klasyczną detekcję umożliwia przybliżoną identyfikację składników mieszaniny, pełną identyfikację z detektorem masowym.

Typowym przykładem zastosowania spektrometrii mas do analizy mieszanin są badania proteomiczne, gdzie prawie zawsze występują złożone mieszaniny peptydów. Badania te są możliwe dzięki stosowaniu łagodnych metod jonizacji takich jak ESI i MALDI. Podczas stosowania łagodnych metod jonizacji tracona jest informacja o wzorze fragmentacji cząsteczek. Problem ten rozwiązuje zastosowanie tandemowych spektrometrów mas.

Plazma – zjonizowana materia o stanie skupienia przypominającym gaz, złożona zarówno z cząstek naładowanych elektrycznie, jak i obojętnych. Mimo że plazma zawiera swobodne cząstki naładowane, to w skali makroskopowej jest elektrycznie obojętna.
Ładunek elektryczny ciała (lub układu ciał) – fundamentalna własność materii przejawiająca się w oddziaływaniu elektromagnetycznym ciał obdarzonych tym ładunkiem. Ciała obdarzone ładunkiem mają zdolność wytwarzania pola elektromagnetycznego oraz oddziaływania z tym polem. Oddziaływanie ładunku z polem elektromagnetycznym jest określone przez siłę Lorentza i jest jednym z oddziaływań podstawowych.

Analizatory masy

W spektrometrach mas stosowane są różne typy analizatorów masy:

Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF) – jony wprowadzane do analizatora są przyspieszane przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają dryfować przez komorę analizatora. Na końcu analizatora znajduje się detektor jonów połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Pomiar m/z jest oparty na fakcie, że ze wzrostem masy cząsteczkowej jonów, wydłuża się ich czas przelotu. Obecnie stosuje się często analizatory czasu przelotu ze zwierciadłem elektrostatycznym, które zwiększa rozdzielczość aparatu, ale zmniejsza zakres dopuszczalnych mas cząsteczkowych. Analizatory TOF charakteryzują się stosunkowo dużymi rozdzielczościami rzędu kilkudziesięciu tysięcy (do 100 000) oraz dosyć dużą czułością. Są najczęściej stosowane razem ze źródłami jonów MALDI.

Schemat Spektrometru mas z analizatorem typu sektor magnetyczny i źródłem jonów typu EI

Sektor magnetyczny (Magnetic sector) analizator ten wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym. Tor lotu jonów jest zakrzywiany, stopień zakrzywienia lotu zależy od stosunku masy do ładunku (m/z) i prędkości jonu a także od parametrów pola magnetycznego. Sektor magnetyczny charakteryzuje się stosunkowo małą rozdzielczością – mniej niż 5000. Związane jest to głównie z dużymi różnicami prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia. Problem ten rozwiązuje przez zastosowanie sektora elektrycznego przed sektorem magnetycznym, w którym cząsteczki są rozpędzane, dzięki czemu różnice prędkości są mniejsze.

Sektor elektryczny urządzenie to wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu elektrostatycznym, jest zbudowane z dwóch równoległych, zakrzywionych płyt do których przyłożono potencjał elektryczny. Jony o jednakowej energii translacyjnej mają jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym. Za sektorem elektrycznym znajduje się szczelina przez którą przelatują tylko jony o określonej energii. Sektor elektryczny jest stosowany przed sektorami magnetycznymi w spektrometrach mas o podwójnym ogniskowaniu.

Budowa kwadrupola

Kwadrupol (Quadrupole) Analizator ten jest zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów. Działa jako filtr masy – w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z). Dzieje się to dzięki przykładaniu do prętów prądu zmiennego o określonej częstotliwości i napięciu oraz napięcia stałego. Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczał jony o szerokim lub wąskim zakresie m/z. Jony przechodzące przez kwadrupol mogą być poddawane dalszej analizie.

Pułapka jonowa (Ion trap – IT) jest analizatorem pozwalającym na przetrzymywanie jonów. Analizator ten działa na zasadzie podobnej do kwadrupola. Manipulując parametrami prądu przyłączonego do elektrod można uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z) lub można uwięzić jony o szerokim zakresie m/z. Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w pułapce jonów o szerokim zakresie m/z i wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o określonym m/z. Wnętrze pułapki jonowej wypełnione jest gazem obojętnym – helem pod ciśnieniem rzędu 10 Pa. Jeżeli jony w pułapce zostaną wzbudzone (przyspieszone), zderzenia z atomami helu spowodują fragmentację jonów. Pułapki jonowe charakteryzują się zwykle dość niewielką rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz bardzo dużą czułością.

Liniowa pułapka jonowa (Linear Ion Trap, Linear Trap Quadrupole – LTQ) jest zbudowana, jak kwadrupol, z czterech równoległych prętów. Na obu końcach analizatora przykładany jest potencjał elektryczny, który uniemożliwia ucieczkę jonów z analizatora. Pomiar masy odbywa się przez wyrzucanie jonów o określonym m/z z analizatrora i detekcję. W liniowych pułapkach jonowych stosuje się często dwa detektory, co zwiększa czułość. Liniowe pułapki jonowe charakteryzują się bardzo dużą czułością (większą niż zwykłe pułapki jonowe) i stosunkowo niską rozdzielczością (kilka tysięcy). W liniowej pułapce jonowej, jony można przechowywać, poddawać fragmentacji i mierzyć masy fragmentów.

Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR) Analizator cyklotronowy wykorzystuje zjawisko zakrzywienia toru lotu jonów w polu magnetycznym. Jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Widmo m/z jest tworzone przez działanie na jony polem elektromagnetycznym o zmieniającej się częstotliwości i rejestrację zmian natężenia prądu w płytach detektorowych lub zmiany absorpcji fali elektromagnetycznej. W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia – ciśnienie nie większe niż 10 Pa, zwykle 10 Pa lub mniejsze. Rozdzielczości analizatorów cyklotronowych mogą być bardzo duże, zwykle kilkaset tysięcy, mogą dochodzić nawet do miliona (przy m/z 500 Th). Rozdzielczości tych analizatorów szybko zmniejszają się wraz ze wzrostem m/z analizowanej cząsteczki.

Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR) Analizator ten działa podobnie jak analizator cyklotronowego rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną metodę zbierania danych niż w ICR. W analizatorze FT-ICR przy pomocy złożonej fali elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie wszystkie jony. Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał zawierający wiele częstotliwości charakterystycznych dla jonów o różnym m/z. Sygnał ten jest przekształcany w widmo m/z przy pomocy Transformacji Fouriera. Analizatory FT-ICR są znacznie szybsze niż analizatory ICR, inne parametry (rozdzielczość, czułość itp.) są podobne. Analizatory FT-ICR wyparły obecnie z rynku analizatory ICR.

Orbitrap – zbudowany jest z dwóch elektrod zewnętrznych i jednej elektrody wewnętrznej pomiędzy którymi poruszają się jony. Tak więc analizator ten jest rodzajem pułapki jonowej. Elektrody zewnętrzne mają kształt zwężających się na jednym z końców beczek. Elektrody te są ustawione szerszymi końcami do siebie. Wrzecionowata elektroda wewnętrzna umieszczona jest w środku urządzenia, jej oś symetrii pokrywa się z osiami symetrii elektrod zewnętrznych. Jony wprowadzone do analizatora poruszają się dookoła oraz wzdłuż jego osi. Pomiar częstotliwości oscylacji jonów wzdłuż osi analizatora pozwala na obliczenie stosunku masy do ładunku jonu. Analizatory typu orbitrap charakteryzują się dużą rozdzielczością (do 200 000).

Detektory

Zadaniem detektora w spektrometrze mas jest rejestracja jonów, przechodzących przez analizator. Najprostszym i najstarszym detektorem jonów jest płyta fotograficzna. Obecnie płyty fotograficzne zostały zastąpione detektorami przekazującymi informację w postaci sygnałów elektrycznych. Sygnały te są we współczesnych spektrometrach mas przetwarzane na postać cyfrową i dalej analizowane i przechowywane z wykorzystaniem komputerów. Można wyróżnić kilka najczęściej stosowanych typów detektorów:

I wojna światowa – pomiędzy od czasu wojen napoleońskich na kontynencie europejskim zakończony klęską Państw Centralnych, likwidacją mocarstw Świętego Przymierza i powstaniem w Europie Środkowej i południowej licznych państw narodowych. Mimo ogromu strat i wstrząsu nimi wywołanego wojna ta nie rozwiązała większości konfliktów, co doprowadziło do wybuchu II wojny światowej 21 lat po jej zakończeniu.
Anoda (gr. ana - "w górę", hodós - "ścieżka") - rodzaj elektrody, przez którą ładunek ujemny opuszcza dany układ elektryczny lub do układu jest dostarczany ładunek dodatni. W zależności od charakteru układu (kierunku przepływającego przez niego prądu elektrycznego), anoda może być elektrodą dodatnią lub ujemną i występuje zawsze w parze z elektrodą jej przeciwną pod względem znaku, czyli katodą.

Puszka Faradaya – jest to metalowa, cylindryczna komora z otworem przez który wlatują jony. Jony wpadające do detektora trafiają na dno puszki i oddają swój ładunek. Powstający w ten sposób prąd jest mierzony. Detektory te charakteryzują się małą czułością.

Powielacz elektronowy – detektor zbudowany jest z serii płytek, do których przyłączono wysokie napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę (dynodę konwersyjną), powodują emisję elektronów. Elektrony te uderzają w kolejną płytkę (dynodę) powodując wybicie większej liczby elektronów. Z każdej, kolejnej płytki detektora wybijane jest coraz więcej elektronów – sygnał jest wzmacniany. Elektrony trafiają ostatecznie na anodę powodując przepływ prądu, który jest mierzony. W nowszych konstrukcjach powielaczy elektronowych serię dynod zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą (powielacz elektronowy o dynodzie ciągłej). Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury powodując emisję kolejnych elektronów. Dzięki kaskadowemu wzmocnieniu sygnału powielacze elektronowe są detektorami bardzo czułymi.

Detektor mikrokanalikowy – detektor zbudowany z płytki z niewielkimi (4-25 μm), zakrzywionymi otworami. Powierzchnia otworów pokryta jest półprzewodnikiem mającym zdolność emisji elektronów. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał ujemny (napięcie rzędu 1 kV) w stosunku do strony wyjściowej. Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze ścianami otworów powodując kaskadową emisję elektronów, podobnie jak w powielaczu elektronowym. Za każdym z kanalików znajduje się metalowa anoda zbierająca elektrony. Sygnał powstały w ten sposób jest mierzony.

Detektor fotopowielaczowy – składająca się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla jonów dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu fluorescencyjnego i fotopowielacza. Jony wpadające do detektora uderzają w dynodę konwersyjną powodując emisję elektronów. Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny przy pomocy pola elektrycznego. Po uderzeniu elektronu w ekran emitowane są fotony, które trafiają do fotopowielacza. Fotopowielecz wzmacnia sygnał, który potem jest rejestrowany.

Detekcja w analizatorze cyklotronowego rezonansu jonów (ICR) – Analizatory ICR są jednocześnie detektorami jonów, nie wymagają one instalacji dodatkowych detektorów.

Klasyczna technika identyfikacji związków chemicznych

Wysokorozdzielczy spektrometr mas Finnigan MAT 95 ze źródłem jonów EI/CI/FAB i analizatorem magnetycznym i elektrycznym. Własność CBMiM PAN

Klasyczna technika spektroskopii masowej polega na umieszczaniu w komorze jonizacyjnej czystych związków chemicznych, które następnie ulegają fragmentacji z użyciem techniki FAB lub EI. Widma czystych związków chemicznych otrzymywane techniką FAB lub EI przy określonej energii bombardujących cząstek prowadzą do zawsze takiego samego obrazu fragmentacji cząsteczki. Jednocześnie, niezwykle rzadko zdarza się, aby dwa różne związki chemiczne fragmentowały się w identyczny sposób. Widma masowe mogą być zatem z powodzeniem stosowane do identyfikacji związków chemicznych, aczkolwiek nie ze 100% pewnością. Dzięki temu, że określone grupy związków chemicznych ulegają fragmentacji w określony sposób, widma masowe umożliwiają też określenie prawdopodobnej struktury związków. Analizowanie widm masowych pod tym kątem jest jednak dość kłopotliwe i nie zawsze prowadzi do jednoznacznych konkluzji. Widma masowe są jednak stosowane jako komplementarna metoda w analizie, do NMR i spektroskopii IR przy ustalaniu struktur związków organicznych.

Centre National de la Recherche Scientifique, CNRS (fr. Krajowe Centrum Badań Naukowych) - francuska państwowa instytucja naukowa, skupiająca się na rozwoju dyscyplin naukowych oraz technicznych, będąca pod kuratelą francuskiego ministra do spraw nauki.
Czas retencji - wielkość występująca we wszystkich technikach chromatograficznych, równa ilości czasu potrzebnego do przejścia przez całą długość fazy rozdzielczej określonego składnika analizowanej mieszaniny.

czytaj dalej: [2], [3]

w oparciu o Wikipedię (licencja GFDL, CC-BY-SA 3.0, autorzy, historia, edycja)