• Artykuły
  • Forum
  • Ciekawostki
  • Encyklopedia
  • Wytwarzanie kompleksów białkowych ułatwione

    16.06.2009. 15:11
    opublikowane przez: Maksymilian Gajda

    Białka są głównym budulcem żywych organizmów. Odgrywają również podstawową rolę w wielu procesach komórkowych. Jednakże te skomplikowane procesy są w większości kierowane przez wiele białek wchodzących w interakcje w ramach kompleksów białkowych. Nowa metoda wytwarzania kompleksów wielobiałkowych, opracowana przez naukowców, których prace zostały w części sfinansowane ze środków unijnych, może teraz pomóc w ułatwieniu badań nad tymi ważnymi, ale wciąż nieuchwytnymi kompleksami. Metoda ta może otworzyć drogę do odkrycia miejsc docelowych dla leków, co sprawia, że jest przedmiotem zainteresowania przemysłu farmaceutycznego.

    W artykule opublikowanym w czasopiśmie Nature Methods naukowcy z Europejskiego Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL) wraz z kolegami z Francji, Szwajcarii, Szwecji i Wlk. Brytanii opisują "pierwszą, w pełni zautomatyzowaną linię do wytwarzania kompleksów wielobiałkowych", nazwaną ACEMBL.

    "Badania funkcjonalne i strukturalne, których celem jest rozszyfrowanie fizjologicznie ważnego mechanizmu molekularnego tych kompleksów [wielobiałkowych] nabierają coraz większego znaczenia w biologii" - wyjaśnia zespół badawczy. Jednakże komórki często nie posiadają ich w liczbie wystarczającej do miarodajnej analizy. Co więcej - jak dodają autorzy - "niejednorodny często charakter wielu kompleksów wielopodjednostkowych [ďż˝] często uniemożliwia ich ekstrakcję z naturalnego źródła".

    Aby uniknąć tych przeszkód, biologowie zazwyczaj uciekają się do rekombinacyjnych metod wytwarzania, w których bakterie - najczęściej bakterię jelitową Escherichia coli (E. Coli) - zmusza się do wytwarzania żądanych białek poprzez wprowadzenie rekombinowanego DNA (które nie istnieje w naturze lecz jest tworzone poprzez łączenie sekwencji DNA). Jednakże ta metoda jest skomplikowana i czasochłonna. Ogranicza również złożoność białek, jakie można wytworzyć i utrudnia ich przystosowalność, która ma zasadnicze znaczenie w przypadku konieczności powtórzenia doświadczenia.

    Natomiast nowa metoda ACEMBL wykorzystuje genetyczną inżynierię rekombinacyjną zamiast tradycyjnej inżynierii genetycznej, która wymaga dodatkowych kroków pośrednich oraz dobrze zdefiniowanego odcinka łańcucha DNA, jaki ma zostać zastąpiony. System ACEMBL może wytwarzać kompleksy z różnorodnymi składowymi takimi jak na przykład białka i kwas rybonukleinowy (RNA).

    "Układy genów, kodujące podjednostki konkretnego kompleksu wielobiałkowego oraz potencjalnie również białka pomocnicze (towarzyszące białku, które pełni podstawową funkcję i wspierające je) [...] mogą być składane, rozkładane i wymieniane za pomocą systemu ACEMBL" - twierdzą naukowcy. "Otwiera on intrygujące możliwości przed kombinatoryczną analizą interakcji białko-białko lub interakcji między kompleksami białkowymi a modyfikatorami."

    Obecnie w pełni zautomatyzowany system ACEMBL - podobnie jak systemy tradycyjne - opiera się na badaniach bakterii E. coli. "E. coli nadal pozostaje głównym materiałem badawczym w większości laboratoriów z wielu powodów, takich jak niskie koszty i dostępność wielu szczepów o wyspecjalizowanej ekspresji" - czytamy w artykule. W przyszłości naukowcy mają nadzieję dostosować go do wytwarzania w bardziej złożonych komórkach i bardziej złożonych systemach funkcjonujących w organizmie człowieka.

    Prace zostały w części sfinansowane z unijnych projektów, w tym z projektu SPINE2C (Od receptora do genu - budowa kompleksów ze ścieżek sygnalizacyjnych łączących immunologię, neurobiologię i raka) oraz z projektu 3D-Repertoire (Interdyscyplinarne podejście do określania budowy kompleksów wielobiałkowych w organizmie modelowym) Szóstego Programu Ramowego. Dofinansowanie pochodziło również z "Europejskich infrastruktur na rzecz biologii strukturalnej" (INSTRUCT) oraz "Platform wytwarzania białek" (PCUBE), finansowanych z Siódmego Programu Ramowego (7PR).

    Źródło: CORDIS

    Więcej informacji:

    Nature Methods:
    http://www.nature.com/nmeth

    Europejskie Laboratorium Biologii Molekularnej:
    http://www.embl-heidelberg.de

    Instytut im. Paula Scherrera:
    http://www.psi.ch

    Źródło danych: Nature Methods; Instytut im. Paula Scherrera
    Referencje dokumentu: Bieniossek C., et al. (2009) Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nature Methods 6:447-50. DOI: 10.1038/nmeth.1326.

    Czy wiesz ĹĽe...? (beta)
    Remodeling chromatyny nazywany także rearanżacją chromatyny stanowi proces polegający na zmianie struktury chromatyny przy pomocy określonych kompleksów białkowych, którego celem jest regulacja ekspresji genów poprzez zmianę dostępności chromatyny dla czynników transkrypcyjnych. Pierwsze białka zdolne do remodelowania struktury przestrzennej chromatyny zostały odkryte na początku lat 90. XX wieku. Do chwili obecnej udało się dość dobrze zbadać budowę i mechanizm działania niektórych czynników białkowych biorących udział w tym procesie. Kinazy białkowe – grupa kinaz, których substratami są białka. Enzymy te przeprowadzają reakcję fosforylacji cząsteczki specyficznego dla danej kinazy białka. Fosforylacja zwykle prowadzi do zmiany konformacji cząsteczki białka i, w konsekwencji, zmiany jego aktywności, zdolności do wiązania się z innymi białkami albo przemieszczenia cząsteczki w obrębie komórki. Do 30% białek podlega regulacji na tej drodze; większość szlaków metabolicznych komórki, zwłaszcza sygnalizacyjnych, angażuje enzymy z grupy kinaz białkowych. W ludzkim genomie zidentyfikowano kilkaset genów kodujących sekwencje aminokwasowe kinaz białkowych (około 2% wszystkich genow). Funkcja kinaz białkowych podlega wielostopniowej regulacji, również angażującej kinazy i fosfatazy białkowe; fosforylacja białka kinazy może zwiększać albo zmniejszać jej aktywność. Białka aktywatorowe lub inhibitorowe przez przyłączanie się do domen regulatorowych kinaz również wpływają na ich aktywność. Niektóre kinazy posiadają domenę regulatorową, którą same mogą fosforylować (autofosforylacja albo cis-fosforylacja). Kulliny - rodzina kompleksów białkowych, odpowiedzialnych za przyłączanie innych białek cyklu regulacji proteasomu. Złożone są z rdzenia (produkt genów cul) oraz kilku podjednostek regulacyjnych (najczęściej trzech: Rbx1, Skp, kasety F), zmieniających powinowactwo rdzenia kulliny do mediatorów cyklu regulacji proteasomu 26S. Asocjacja wszystkich regulatorów do rdzenia kulliny oraz jej neddylacja (przyłączenie białka Nedd8) powoduje utworzenie aktywnej formy, tzw. kompleksu ligazy SCF, zdolnej do ubikwitynacji.

    Biologia strukturalna – dziedzina biologii znajdująca się na pograniczu biologii molekularnej, biochemii oraz biofizyki, zajmująca się badaniem przestrzennej struktury dużych biocząsteczek, takich jak białka i kwasy nukleinowe. Badania te mają podstawowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmu większości procesów zachodzących w komórce takich jak oddychanie komórkowe czy obróbka informacji genetycznej, ponieważ zaangażowane są w nie cząsteczki białek, których funkcja jest ściśle powiązana z ich budową. W biologii molekularnej, kinom organizmu to zestaw (genów dla) kinaz białkowych w jego genomie. Kinazy białkowe są grupą enzymów katalizujących reakcje fosforylacji reszt aminokwasowych białek. Kinazy dzielą się na podgrupy i rodziny, np. w zależności od substratu, którym może być reszta serynowa (kinazy serynowe), reszta treoninowa (kinazy treoninowe) lub obie reszty aminokwasowe (kinazy serynowo-treoninowe, np. należące do rodzin MAP2K i GSK). Termin "kinom" został użyty po raz pierwszy w 2002 roku przez Gerarda Manninga i wsp. w dwóch pracach opisujących 518 ludzkich kinaz białkowych i przebieg ewolucji kinaz białkowych u eukariontów. Opisano również kinom ryżu, różnych grzybów, nicieni, owadów, jeżowców i śluzowca Dictyostelium.

    Kompleks SAGA, SAGA – wielobiałkowy kompleks u drożdży, katalizujący i regulujący ekspresję genomu. Składa się przynajmniej z 15 białek o łącznej masie ok. 1,8 miliona i ma wymiary 18x28 nm (wiekszy od oktameru rdzeniowego histonu). W skład SAGA wchodzi białko GCN5 o aktywności HAT (acetylotransferaza histonów), grupa białek podobnych do bialka TBP oraz pięć białek TAF Foxp3 (ang. forkhead box P3; synonimy: skurfina, IPEX, DIETER, AIID, PIDX, XPID) – czynnik transkrypcyjny odgrywający istotną rolę w regulacji odpowiedzi odpornościowej. Jest on kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym odpowiedzialnym za powstawanie limfocytów T regulatorowych, szczególnie poprzez aktywację genów istotnych dla funkcjonowania tych komórek oraz modyfikowanie sygnału biegnącego od TCR. Gen kodujący białko Foxp3 zlokalizowany jest na chromosomie X (miejsce Xp11.23). Mimo że Foxp3 jest białkiem kojarzonym głównie z limfocytami Treg, jego ekspresję potwierdzono również w komórkach nowotworowych . Mutacje genu FOXP3 prowadzące do wytwarzania niefunkcjonalnego białka powodują brak wytwarzania limfocytów Treg w organizmie. Prowadzi to do choroby genetycznej IPEX, charakteryzującej się m.in. wielonarządowym zapaleniem .

    Białka fuzyjne (białka chimeryczne) – białka powstające z połączenia 2 lub większej liczby genów, które pierwotnie były odpowiedzialne za produkcję niezależnych białek. Produktem genu fuzyjnego jest białko (polipeptyd), którego funkcja jest w pewnym stopniu pochodną funkcji białek kodowanych przez geny wchodzące w skład takiego połączenia. Sekwencja regulatorowa genu (ang. gene regulatory sequence) – fragment DNA, który reguluje ekspresję genu. Do sekwencji regulatorowej przyłączają się białka regulujące transkrypcję, takie jak: czynniki transkrypcyjne i remodelatory, oraz polimeraza RNA. Kombinacja tych sekwencji, wraz z kombinacją czynników białkowych dostępnych w jądrze komórkowym i ich aktywności, sprawia, że poziom ekspresji genu jest regulowany w zależności od typu, stanu metabolicznego komórki i bodźców zewnętrznych.

    Jądro komórkowe, nukleus - otoczone błoną organellum obecne we wszystkich komórkach eukariotycznych, z wyjątkiem tych, które wtórnie je utraciły w trakcie różnicowania, np. dojrzałe erytrocyty ssaków. Zawiera większość materiału genetycznego komórki, zorganizowanego w postaci wielu pojedynczych, długich nici DNA związanych z dużą ilością białek, głównie histonowych, które razem tworzą chromosomy. Geny zlokalizowane w chromosomach stanowią genom komórki. Funkcją jądra komórkowego jest przechowywanie i powielanie informacji genetycznej oraz kontrolowanie czynności komórki, poprzez regulowanie ekspresji genów. Główne struktury, które obecne są w budowie jądra komórkowego to błona jądrowa, podwójna membrana otaczająca całe organellum i oddzielająca je od cytoplazmy oraz blaszka jądrowa, sieć delikatnych włókienek białkowych utworzonych przez laminy, stanowiących rusztowanie dla jądra i nadających mu wytrzymałość mechaniczną. Błona jądrowa jest nieprzepuszczalna dla większości cząsteczek, dlatego obecne są w niej pory jądrowe. Są to kanały przechodzące przez obie błony, umożliwiające transport jonów i innych cząstek. Transport większych cząstek, takich jak białka, jest ściśle kontrolowany i zachodzi na zasadzie transportu aktywnego, kontrolowanego przez białka transportowe. Transport jądrowy jest kluczowy dla funkcjonowania komórki, ponieważ przemieszczanie cząstek poprzez błonę jądrową wymagane jest zarówno przy zarządzaniu ekspresją genów oraz utrzymywaniu chromosomów.

    Białka wiążące DNA – szeroka klasa białek posiadających motywy strukturalne pozwalające im na wiązanie się do dwu- lub jednoniciowego DNA. Przykładem takich białek mogą być czynniki transkrypcyjne, których funkcją jest regulacja ekspresji genów oraz niektóre polimerazy zależne od kwasów nukleinowych, zaangażowane w replikację DNA i transkrypcję na mRNA.

    Centralny dogmat biologii molekularnej – hipoteza według której przepływ informacji genetycznej następuje od DNA poprzez RNA do białka. Hipoteza ta została sformułowana przez Francisa Cricka na corocznym spotkaniu Towarzystwa Biologii Eksperymentalnej w 1957 roku Proteinoplast, proteoplast – plastydy zawierające wyjątkowo dużo, widocznych pod mikroskopem, inkluzji białkowych. Białka te pełnia rolę substancji zapasowych. Proteinoplasty występują w nasionach wielu gatunków roślin. W ostaniach dziesięcioleciach nie opublikowano żadnych prac naukowych na temat proteinoplastów.. W komórkach korzeni tytoni białka obecne w proteinoplastach składką się z białek zawierających hem i raczej nie pełnią funkcji materiału zapasowego.

    Nadrodzina immunoglobulin (synonim: białka immunoglobulinopodobne, ang. immunoglobulin superfamily, IgSF) – grupa białek wyodrębniona na podstawie istnienia w ich strukturze tzw. splotu immunoglobulinowego. Większość członków tej rodziny to białka o masie cząsteczkowej 70-100 kDa. Nadrodzina immunoglobulin jest uznawana za największą grupę białek o podobnej budowie. Na podstawie analizy genomu człowieka zidentyfikowano 756 genów, których produkty białkowe zawierają domenę immunoglobulinową . Białka immunoglobulinopodobne spotykane są również u bakterii, a ich analiza wskazuje, że pochodzą one od genów eukariotycznych i zostały nabyte w trakcie ewolucji na drodze poziomego transferu genów . Koimmunoprecypitacja - metoda badania interakcji między białkami. Wykorzystując tę metodę wprowadza się do mieszaniny białek przeciwciało wiążące się selektywnie z jednym z nich (przeważnie dobrze poznanym), dociążone kulkami sefarozowymi (kulki są opłaszczone cząsteczkami przeciwciała), a następnie wiruje całość w wirówce laboratoryjnej i bada skład osadu z dna probówki. Jeśli w uzyskanym materiale znajdą się dwa białka, można sądzić, że drugie białko utworzyło kompleks z tym, które wychwycono za pomocą przeciwciała i dzięki temu osadziło się wraz z nim, a więc, że między tymi białkami zaszła interakcja.

    Białka fibrylarne (białka włókniste, włókienkowe lub włókiennikowe, skleroproteiny, skleroproteidy, albuminoidy) - białka proste o strukturze włókienkowej stanowiące podstawowy materiał budulcowy organizmów zwierzęcych.

    Dodano: 16.06.2009. 15:11  


    Najnowsze